Oswaldo Gonçalves Cruz, ou simplesmente, Oswaldo Cruz, nasceu em São Paulo, na cidade de São Luís do Paraitinga, em 5 de agosto de 1872. Filho primogênito do médico Bento Gonçalves Cruz e de Amália Bulhões Cruz, teve cinco irmãs. Quando tinha apenas cinco anos de idade, a família mudou-se para o Rio de Janeiro, mais especificamente para o bairro da Gávea, então distante subúrbio carioca. Durante a infância e adolescência estudou no Colégio Laure, no Colégio São Pedro de Alcântara e no Externato Dom Pedro II. Seu pai, o carioca Bento Gonçalves Cruz, logo após a formatura em medicina, foi para o interior de São Paulo em busca de crescimento profissional, mas, em 1877, voltou para o Rio de Janeiro, onde montou consultório na própria residência e conseguiu um emprego no ambulatório da Fábrica de Tecidos Corcovado, situada no mesmo bairro. Anos depois foi nomeado pelo imperador Dom Pedro II, membro da Junta Central de Higiene. Em 1890, já sob o regime republicano, o pai de Oswaldo Cruz tornou-se ajudante do chefe da Inspetoria de Higiene, órgão que sucedera a Junta, chegando ao cargo de inspetor-geral. Porém, afastou-se da função devido a uma nefrite que o levaria à morte, com 47 anos, e por acaso, no mesmo dia em que filho se formava em medicina.​​​​

Oswaldo Cruz sofreu influência imediata do seu pai e de seus colegas médicos e cientistas. Eram em sua maioria, catedráticos no serviço sanitário, higienistas e do ramo da microbiologia. Inspirado, portanto, por esse contexto, aos quinze anos, iniciou seus estudos em 1887 na Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro. Como acadêmico, foi preparador assistente no gabinete de física, sob a orientação do professor de física médica, João Martins Teixeira, e, posteriormente, estagiário do laboratório de bacteriologia do Departamento de Higiene, sob a chefia de Benjamin Antônio da Rocha Faria, função que lhe despertou maior interesse. Nessa época, montou um pequeno laboratório no porão de casa e contou com o apoio de seu pai. Antes mesmo de concluir o curso, publicou dois artigos sobre microbiologia na revista Brasil Médico.

Em 1892, formou-se em Medicina com a tese "A vehiculação microbiana pelas águas". Em 5 de janeiro de 1893, com vinte anos, casou-se com Emília Fonseca, filha de um próspero comerciante português, o comendador Manuel Fonseca. Assumiu, então, a clínica do pai no bairro da Gávea e também o cargo por ele ocupado no ambulatório da Fábrica de Tecidos Corcovado. O casal teve seis filhos: Elisa, Bento, Hercília, Oswaldo Filho, Zahra e Walter. Os três homens seguiram a trajetória do pai e cursaram medicina. Oswaldo e Walter trabalhariam futuramente no Instituto Oswaldo Cruz. Bento, o mais velho, não exerceu a profissão.

Através do auxílio financeiro do sogro, montou em casa um laboratório de análises e pesquisas. Nos dois anos seguintes, a convite do médico Egídio Sales Guerra (que anos mais tarde se tornaria seu médico particular e principal biógrafo), foi trabalhar na Policlínica Geral do Rio de Janeiro - uma instituição filantrópica criada em 1882 por iniciativa de médicos da Faculdade de Medicina – em um laboratório de análises clínicas que fornecia diagnósticos ao Serviço de Moléstias Internas, do qual Sales Guerra era chefe, e no Serviço de Dermatologia, dirigido pelo médico Antônio José Pereira da Silva Araújo. Neste último, passou a integrar, com Sales Guerra, Silva Araújo, Werneck Machado e Alfredo Porto, o “grupo dos cinco germanistas”, nome recebido devido ao empenho que tinham em aprender o alemão, com vistas a ter acesso aos estudos dos bacteriologistas germânicos.

Apesar de seu interesse pela bacteriologia alemã, em 1897 embarcou com a esposa e os dois primeiros filhos para Paris, com o objetivo de estudar microbiologia, soroterapia e imunologia, no Instituto Pasteur. Ao se matricular no Instituto, foi surpreendido ao ganhar uma bolsa de estudos do diretor, Émile Roux, por reconhecimento à ajuda financeira que o imperador Pedro II dera à instituição. Sempre mostrou interesse por estudos relacionados à doenças infecciosas e epidemias. Seus artigos fundamentavam-se não apenas na forte tradição higienista, prevalecente na Faculdade de Medicina, quanto na microbiologia, de Louis Pasteur e de Robert Koch.

Ao se instalar e se socializar no famoso instituto, aproveitou para se especializar também em urologia e medicina legal, pois naquele momento não havia especialistas nessas áreas no Brasil. Interessou-se pela confecção de ampolas, provetas e pipetas. Adquiriu os conhecimentos técnicos para a criação de utensílios fundamentais de laboratório, o que lhe tornaria pioneiro na fabricação desses instrumentos no Brasil, organizando alguns anos mais tarde, no Instituto Soroterápico Federal um serviço destinado a produzir esse tipo de vidraria. Adquiriu uma câmera em Paris capaz de fazer fotos estereoscópicas que produziam imagens com efeito tridimensional, montando um pequeno laboratório para revelação de fotografias em sua casa. Sua estada em Paris foi de dois anos e três meses, e em 1899 retornou ao Brasil.

Ao chegar, se deparou com um forte surto de peste bubônica. Reassumiu o cargo na Policlínica Geral e juntou-se à comissão de Eduardo Chapot-Prévost para estudar a mortandade de ratos que gerou o surto da peste em Santos. Diante das dificuldades de obter o soro antipestoso, produzido exclusivamente no Instituto Pasteur de Paris, as autoridades sanitárias fundaram institutos soroterápicos para a sua fabricação. Em São Paulo, sob a orientação de Adolpho Lutz e Vital Brazil, estabeleceu-se um laboratório vinculado ao Instituto Bacteriológico, mais adiante nomeado Instituto Butantan. Na capital federal, fundou-se o Instituto Soroterápico Federal, também chamado de Instituto de Manguinhos. Assim, Oswaldo Cruz foi convidado para assumir a direção técnica, sob o comando do Barão de Pedro Affonso, proprietário do Instituto Vacínico Municipal, com quem teve muitas divergências. Lá foi encarregado da produção do soro antipestoso junto com Henrique Figueiredo de Vasconcelos, seu companheiro de escola, e os estudantes de medicina Antônio Cardoso Fontes e Ezequiel Dias.

No Instituto Soroterápico, Oswaldo Cruz ampliou a fabricação de soro antipestoso e investiu na formação de novos pesquisadores. Em 1902, assumiu a direção geral do Instituto e no ano seguinte, chegou ao comando da Diretoria-Geral de Saúde Pública (DGSP), por nomeação do presidente Rodrigues Alves. Coordenou uma importante campanha sanitária de combate às principais doenças da capital federal: febre amarela, peste bubônica e varíola. Adotou o isolamento dos doentes, como principal forma de não proliferação de doenças, a notificação compulsória dos casos positivos, a captura dos vetores – mosquitos e ratos – e a desinfecção das moradias em áreas de focos. Desenvolveu campanhas de saneamento e, em poucos meses, a incidência de peste bubônica havia diminuído com o extermínio dos ratos. Contrariando a posição de médicos, cientistas e a opinião da população leiga, Oswaldo Cruz defendeu a teoria de que o transmissor da febre amarela era um mosquito. Assim, suspendeu as desinfecções, que era o método tradicional no combate à moléstia, e implantou medidas sanitárias com brigadas que percorreram casas, jardins, quintais e ruas, para eliminar focos de insetos. Sua atuação provocou violenta reação popular.

Com o aumento dos surtos de varíola, em 1904 o sanitarista tentou promover a vacinação em massa da população. No entanto, deparou-se com uma forte resistência da população e da imprensa, que pouco conheciam sobre os benefícios da vacina. O congresso protestou e foi organizada a Liga Contra a Vacinação Obrigatória. No dia 13 de novembro, estourou uma rebelião popular e, no dia 14, a Escola Militar da Praia Vermelha se levantou. O Governo derrotou a rebelião, que durou uma semana, mas suspendeu a obrigatoriedade da vacina. Mesmo assim, em 1907, a febre amarela estava erradicada do Rio de Janeiro. Em 1908, em uma nova epidemia de varíola, a própria população procurou os postos de vacinação.

Em 1905 foi iniciada a construção, na Fazenda de Manguinhos, do Pavilhão Mourisco, ou Castelo de Manguinhos, idealizado por Oswaldo Cruz, que foi concluído apenas em 1918, após seu falecimento.

Entre 1905 e 1906, Oswaldo Cruz empreendeu uma expedição a 30 portos marítimos e fluviais de Norte a Sul do país para estabelecer um código sanitário com regras internacionais. O reconhecimento internacional começou em 1907, quando Oswaldo Cruz recebeu a medalha de ouro no 14º Congresso Internacional de Higiene e Demografia de Berlim, na Alemanha, pelo trabalho de saneamento do Rio de Janeiro. Oswaldo Cruz ainda reformou o Código Sanitário e reestruturou todos os órgãos de saúde e higiene do país. Em missão diplomática, assegura ao presidente americano Theodore Roosevelt as boas condições sanitárias da capital federal. No ano seguinte retorna ao Brasil e é recebido como herói nacional.

Em 1907 o Instituto Soroterápico Federal passou a ser denominado Instituto de Patologia Experimental de Manguinhos e no ano seguinte recebeu a designação de Instituto Oswaldo Cruz. Com a sua equipe do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) lançou importantes expedições pelo país e realizou o levantamento de suas condições sanitárias. Em 1910 fizeram uma importante campanha de estudos sobre malária que levou a morte de centenas de operários envolvidos na construção da Ferrovia Madeira-Mamoré. Também erradicou a febre amarela no Pará e realizou campanha de saneamento da Amazônia.

Em 1913, apesar de divergências de críticos, por não ser um intelectual da área literária, foi eleito para a Academia Brasileira de Letras.

Em 1914, em meio a Primeira Guerra Mundial, viaja com a família para Paris e retorna ao Brasil no ano seguinte. Os sintomas de sua doença renal, iniciados em 1907, tinham se acentuado. Ainda assim, correspondendo ao pedido do presidente Nilo Peçanha, trabalhou em um estudo de combate à formiga saúva, causadora de grandes prejuízos agrícolas.

Em 1915, foi aos poucos se distanciando do IOC, e firmou residência em Petrópolis, para tratar melhor de sua saúde. Como era muito jovem ainda, a família tinha receio de que a distância do trabalho pudesse lhe debilitar ainda mais, então, Bento, seu filho mais velho, utilizou da respeitabilidade de seu pai e pediu a Nilo Peçanha, que o nomeasse para a recém-criada prefeitura de Petrópolis. Em 1916, o sanitarista afastou-se definitivamente de Manguinhos, e em 17 de agosto do mesmo ano, tornou-se o primeiro prefeito da cidade. Tão logo tomou posse, preparou um plano de governo que incluía, entre outras metas, a construção de rede de esgotos e a organização dos serviços sanitários da cidade. Os carros de tração animal da prefeitura seriam substituídos por automóveis; uma linha circular de bondes elétricos ligaria os bairros de Petrópolis, e outra alcançaria o Rio de Janeiro; as margens dos rios ganhariam o azul das hortênsias; o ensino primário seria organizado; a educação física se tornaria obrigatória e parques seriam construídos para a prática de ginástica; por fim, seriam criados, no Palácio do Império, o Museu Imperial e Jardim Botânico.